Dossier: La Polymérase Chain Reaction ( PCR). La révolution de la biomol.

La PCR est une méthode de biologie moléculaire d'amplification rapide d'une séquence déterminée d'ADN ou D'ARN à partir d'une matrice même de faible quantité en acides nucléiques (de l'ordre de quelques picogrammes). Elle permet d'obtenir plusieurs millions voire milliards de copies identiques de cette séquence. Elle fut inventée par Kary B. MULLIS en 1985 (Entreprise Cetus en Californie), qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Il travaillait sur le diagnostic d'HbS chez des nouveaux-nés. La première publication date du 20 décembre 85 parut dans Science (PDF).

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est sans doute le laboratoire le plus puissant jamais inventé qui a conduit à une véritable révolution de la génétique.

En revanche, la PCR en temps réel a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et est encore considérée comme une méthodologie nouvelle. Le nombre d'articles par année répondant aux mots clés « polymerase chain reaction » et « real-time polymerase chain reaction » sur le moteur de recherche PubMed donne une assez bonne idée de leur importance dans le monde scientifique.

Cette technique a largement évolué depuis ses débuts. Parmi les évolutions les plus fondamentales, on retrouve :le remplacement du fragment de Klenow d’ADN polymérase I d’E . coli par une polymérase thermorésistante (initialement la Taq) qui évite de devoir remettre de l’enzyme à chaque cycle. Cette innovation permet un bond énorme vers l’automatisation et évite de devoir ouvrir le tube réactionnel, limitant considérablement le risque de contamination.La généralisation des thermocycleurs (un bon nombre d’anciennes expérimentations ont été réalisées avec trois bains-marie) a permis de rendre la PCR moins contraignante, plus reproductible et était un pré requis indispensable à la plupart des applications nouvelles.L’invention de la PCR en temps réel qui permet de rendre la méthode quantitative et évite plusieurs étapes expérimentales contraignantes, telles l’électrophorèse sur gel d’agarose, l’acquisition de fluorescence, la calibration de l’acquisition du signal, etc.

Quelques Applications de la PCR :

Le diagnostic des maladies

La recherche d'une pathologie:( En parasitologie en bactériologie (ex : tuberculose),en virologie, en oncologie (gènes impliqué dans la cancérogenèse)...On met en évidence l'absence, ou la présence, dans le prélèvement d'un fragment d'ADN spécifique de l'agent causal. D'autres applications peuvent être citées telles que la recherche d’OGM
ou encore la détection de polymorphismes , et le Séquençage
.

Principes Le mélange réactionnel et les cycles de température

La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend l’extrait d’ADN (ADN matriciel), la Taq polymérase, les amorces et les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans une solution tampon. Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d’un thermocycleur (appareil qui comporte une enceinte où l’on dépose les tubes échantillons et dans laquelle la température peut varier, très rapidement et précisément, de 0 à 100°C par effet Peltier). L’appareil permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes.

La dénaturation : 94°C

La première période s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80°C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires).

L’hybridation : 40 – 70°C

La deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces, courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel. Plus la température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique. 19

Les amorces (primers)

Pour parvenir à amplifier sélectivement des séquences nucléotidiques à partir d’un extrait d’ADN par PCR, il est indispensable de disposer d’au moins une paire d’oligonucléotides. Ces oligonucléotides, qui vont servir d’amorces pour la réplication, sont synthétisés par voie chimique et doivent montrer la meilleure complémentarité possible avec les deux extrémités de la séquence d’intérêt que l’on souhaite amplifier. L’une des amorces est conçue pour reconnaître par complémentarité une séquence située en amont du brin 5’-3’ du fragment d’ADN d’intérêt ; l’autre pour reconnaître, toujours par complémentarité, une séquence située en amont du brin complémentaire (3’-5’) du même fragment d’ADN. Les amorces sont des ADN monocaténaires dont l’hybridation sur les séquences flanquant la séquence d’intérêt permettra sa réplication de façon sélective. La taille des amorces est généralement comprise entre 10 et 30 nucléotides afin de garantir une hybridation suffisamment spécifique sur les séquences d’intérêt de l’ADN matriciel. D’autres critères, importants mais secondaires par rapport aux précédents, doivent être pris en compte pour la conception et l’emploi des amorces. La séquence des amorces doit comporter la plus grande proportion possible de guanines et de cytosines. En effet, la liaison entre guanines et cytosines est assurée par trois liaisons hydrogène au lieu de deux entre les adénines et les thymines, ce qui se traduit par une meilleure stabilité de la liaison au moment de l’hybridation des amorces. Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus leur température d’hybridation (Tm) peut être élevée (elle est en général comprise entre 40 et 65°C, mais peut atteindre 70°C) et donc plus la spécificité À des températures d’hybridation basses, les amorces s’hybrident de façon beaucoup moins sélective ce qui peut se traduire par l’amplification de séquences d’ADN non souhaitées (amplification non spécifique). Les pourcentages en guanines et cytosines de chaque membre du couple d’amorces doivent être aussi proches que possible car la proportion de guanine et cytosine détermine la température d’hybridation. Si ces proportions diffèrent significativement d’une amorce à l’autre, il est très malaisé de définir une température d’hybridation convenable et qui permette une hybridation équilibrée des amorces. Il ne faut pas non plus que les amorces présentent de fortes complémentarités de séquence sans quoi elles s’associeraient entre elles et n’effectueraient pas correctement l’amorçage de la réplication. Il faut encore noter que certaines modifications chimiques du milieu réactionnel permettent d’optimiser la spécificité d’hybridation des amorces. L’ajout de détergent ou de glycérol, par exemple, inhibe la formation des liaisons hydrogène, rend plus difficile l’hybridation des amorces et donc favorise sa spécificité.

L’élongation : 72°C

La troisième période s’effectue à une température de 72°C, dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice et au bout de quelques cycles, l’espèce prédominante correspond à la séquence d’ADN comprise entre les régions où les amorces s’hybrident. Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une quantité analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d’ADN présente au cours du cycle précédent. Il est recommandé de rajouter un cycle final d’élongation à 72°C, notamment lorsque la séquence d’intérêt est de grande taille (supérieure à 1 kilobase), à raison de 2 minutes par kilobase. La PCR permet d’amplifier des séquences dont la taille est inférieure à 6 kilobases.

La Taq polymérase L’ADN polymérase permet la réplication. On utilise une ADN polymérase purifiée ou clonée à partir d’une bactérie extrêmophile, Thermus aquaticus, qui vit dans les sources chaudes et résiste à des températures supérieures à 100°C. Cette polymérase (Taq polymérase) possède la caractéristique remarquable de résister à des températures de l’ordre de 100°C, lesquelles sont généralement suffisantes pour dénaturer la plupart des protéines. Thermus aquaticus trouve sa température de confort à 72°C, température optimum pour l’activité de sa polymérase.