Méthodes de Diagnostic virologique
1 . Les cibles de la détection des virus Toutes les infections virales ne nécessitent pas l'intervention du laboratoire.Si le contexte clinique ou la gravité des symptômes le justifient, le diagnostic virologique fait appel soit aux méthodes indirectes, soit aux méthodes directes. Parmi ces dernières, le diagnostic moléculaire occupe une place de plus en plus importante.
2 . Diagnostic indirect : sérologies virales
Pour le diagnostic d’une infection en cours, il est important d'analyser deux prélèvements consécutifs à 10-15 jours d’intervalle, pour observer une modification significative du taux d’anticorps. La présence d'IgM signe le plus souvent une infection récente ; les IgG persistent très longtemps.Lorsqu’une personne est trouvée positive en sérologie pour la première fois pour le HIV et le HCV, il est légalement obligatoire de vérifier ce résultat sur un second prélèvement (sérologie et western blot).
2. 1. Prélèvements :
Sérum principalement, acheminé au laboratoire à température ambiante.
Autres liquides biologiques : liquide céphalo-rachidien (LCR), liquide amniotique, liquide pleural, liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) ... Dans ce cas, une adaptation « artisanale » de la technique sérologique est souvent nécessaire, ce qui est peu satisfaisant du point de vue de l'assurance qualité.
2.2. Techniques :
Méthodes ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) le plus souvent
Autres réactions sérologiques, plus « traditionnelles », comme la réaction de fixation du complément
2.3. Principe de la réaction ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) :
Formation d’un complexe antigène -anticorps - Sérum supposé contenir les anticorps recherchés - Antigène (réactif commercial) adsorbé sur unsupport plastique (plaque 96 puits)
Détection du complexe antigène-anticorpspar fixation d’un anticorps anti-immunoglobuline humaine marqué (réactif commercial) - par une enzyme (méthode immuno-enzymatique) - par une molécule fluorescente (immuno-fluorescence)
3. Diagnostic direct 3.1. Prélèvements : La qualité du prélèvement conditionne le résultat. Il existe trois situations :
Prélèvements ne nécessitant pas de milieu de transport : amener au laboratoire le prélèvement · dans un tube sec stérile : selles, urines, LCR, prélèvements liquides divers · dans un tube contenant de l'EDTA : sang total pour séparation au laboratoire des cellules mononucléées sanguines (recherche de CMV, EBV,HIV…)
Prélèvements effectués avec un écouvillon stérile immergé dans un milieu de transport fourni par le laboratoire : gorge, vésicules, conjonctives Dans ces deux cas, · acheminer dans les 4 heures au laboratoire (pour préserver l’antigénicité, l’infectiosité ou la qualité des acides nucléiques), · à 4°C en entourant le tube de prélèvement d'un sac de glaçons (pour éviter la prolifération bactérienne) · cas particuliers : - le sang total, à température ambiante - pour les examens de Biologie Moléculaire : tube EDTA+ + + ( pas d’héparine, inhibiteur de la PCR)
Frottis sur lame (l'écouvillon est exprimé sur la lame de verre par le préleveur) : acheminer à sec, à température ambiante
3.2. Les méthodes de diagnostic direct « rapide » Ces méthodes permettent d'obtenir un résultat en quelques heures.
Techniques : · Immunomarquage spécifique d'un virus, sur lame de verre en 1 ou plusieurs « spots » (avec un anticorps dirigé contre une protéine virale), à partir d’un écouvillon ou de cellules mononucléées sanguines isolées au laboratoire. Préciser le virus recherché : un seul immunomarquage possible par « spot ». · Autres possibilités : agglutination de particules de latex sensibilisées, méthode de type ELISA pour la détection automatisée des antigènes, trousses de détection immuno-enzymatique rapide d’antigènes…
Indications : Permettre une prise en charge spécifique et rapide du patient dans certaines circonstances : · pre-partum (HHV), · infections respiratoires (Grippe, Virus Respiratoire Syncytial, virus Parainfluenza, Adénovirus), · diarrhées du nourrisson (Rotavirus, Adénovirus), · recherche d’une infection à CMV infra-clinique chez un patient immunodéprimé (antigénémie pp65).
3.3. Les méthodes de diagnostic direct par culture Les virus sont des parasites obligatoires des cellules : ils sont cultivés dans des cellules eucaryotes entretenues au laboratoire, sous la forme de lignées dites continues ou semi-continues.
Les différentes étapes du diagnostic par culture virale 1. Ensemencement d'une lignée cellulaire avec le prélèvement pathologique. 2. Examen direct quotidien: recherche quotidienne d'un effet cytopathique (ECP) au microscope optique inversé. 3. Si ECP : coloration des cellules, pélevées et étalées sur lame, à la recherche d'inclusions virales et d'altérations cytoplasmiques ou nucléaires, au microscope optique. 4. Immunomarquage spécifique du virus sur lame, avec lecture au microscope optique ou à fluorescence.
Tests rapides (sensibilité variable, attention !)
Tests de confirmation HIV (western blot) et HVC (immunoblot) : les différentes protéines du virus sont présentes, séparément, sur la membrane qui sert de support de réaction. Ces tests permettent de préciser contre quelles protéines virales sont dirigés les anticorps.
3.4. Le diagnosticdirect moléculaire Pour simplifier, trois méthodes principales dominent la routine : l’hybridation moléculaire et ses variantes (hybridation avec amplification du signal ou bDNA, hybridation à la recherche de mutations du génome viral), l’amplification génique ou PCR, et le séquençage nucléotidique.
Les applications quantitatives deviennent courantes
Techniques : Hybridation : Détection directe d’ADN ou d’ARN sur différents supports (tubes, plaques, membranes…)
Principe de l’hybridation moléculaire : 1 - Formation d’un hybride acide nucléique viral du prélèvement (ADN ou ARN)/sonde spécifique du génome viral recherché, sur divers supports : membrane, microplaque, tube … 2 - Détection immuno-enzymatique de l’hybride moléculaire : par anticorps anti-acide nucléique double brin, ou marquage froid de la sonde … puis détection colorimétrique, fluorescente ou chimioluminescente …
3.4.1. Hybridation avec amplification du signal
Principe de l’ADN branché : L’acide nucléique viral (prélèvement) est · adsorbé sur un support grâce à des sondes de capture, puis · détecté grâce à des sondes ramifiées sur lesquelles · s’hybrident des sondes de révélation. Des molécules luminescentes sont présentes sur les sondes de révélation; le signal luminescent est proportionnel au nombre de molécules d'acide nucléique viral adsorbées. L'utilisation simultanée de nombreuses sondes ramifiées, complémentaires de différentes régions du génome viral cible, permet la détection de virus génétiquement très variables (HIV, HVC). Le grand nombre de molécules luminescentes en jeu permet une diminution du seuil de détection, sans risque de contamination (il n’y a pas amplification de l’acide nucléique, contrairement à une PCR)
